Comprender el factor de obstáculo de la proliferación bacteriana y γ.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 11464 (2023) Citar este artículo

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El ácido γ-aminobutírico (GABA) es una sustancia que favorece la salud mental y ayuda a liberar la ansiedad y la depresión y mejora la memoria. Se ha introducido Lactiplantibacillus plantarum SKKL1, una bacteria productora de GABA, para formular un producto para el eje intestino-cerebro. Sin embargo, el crecimiento y el consumo de azúcar de L. plantarum SKKL1 en la leche fueron ineficaces. Este obstáculo se investigó variando diferentes tipos de leche, azúcares, temperaturas y tiempos de fermentación. Los resultados revelaron que ninguno de estos parámetros mejoró el crecimiento y el metabolismo bacteriano en la leche, excepto la adición de proteína soluble como la que se encuentra en el extracto de levadura y el extracto de malta. Aunque se descubrió una deficiencia de proteasa de L. plantarum SKKL1, no fue una barrera principal para la propagación celular. Los conocimientos de este estudio mostraron claramente que la proteína soluble era un activador metabólico esencial para el crecimiento, el consumo de nutrientes y la síntesis de proteasas, y luego estimulaba la producción de ácido láctico y GABA. Mientras que L. plantarum SKKL1 no utilizó la caseína de la leche ni el hidrolizado de caseína, una estructura proteica compleja con baja solubilidad. La novedad de este estudio es la primera investigación en profundidad que confirma un efecto significativo de la proteína soluble en la fermentación de la leche enriquecida con GABA por L. plantarum SKKL1 como único iniciador sin proteasa ni adición de glutamato monosódico.

El ácido γ-aminobutírico (GABA) es un aminoácido no proteico sintetizado a partir de una reacción de descarboxilación. Esta reacción requiere ácido glutámico como sustrato, glutamato descarboxilasa (GAD) (EC 4.1.1.15) como biocatalizador y vitamina B6 como coenzima en un ambiente ácido1. GABA juega un papel esencial como neurotransmisor inhibidor en el sistema nervioso central. Influye directamente en la personalidad y el manejo del estrés de los mamíferos, lo que resulta en una relajación del cerebro humano, una mejora del sueño y una disminución de la presión arterial2. El GABA se encuentra en muchos tipos de plantas, como las hojas de té y los tomates3. Además, se encuentra entre los metabolitos bacterianos de las bacterias del ácido láctico.

Algunas bacterias del ácido láctico son potencialmente probióticas, que se definen como organismos vivos beneficiosos que pueden sobrevivir en el tracto digestivo humano resistiendo el pH bajo, las sales biliares y las enzimas digestivas. La presencia de probióticos viables en el colon proporciona muchos beneficios al huésped al equilibrar la microflora intestinal, reducir los niveles de colesterol y estimular la inmunidad4. Numerosos estudios han propuesto que el intestino es el segundo cerebro de la humanidad bajo el concepto de que existe un eje de microbiota intestino-cerebro ya que estos sistemas poseen comunicación bidireccional entre el sistema nervioso central y el entérico, vinculando los centros emocionales y cognitivos del cerebro con el intestino periférico. funciones5.

Para promover la microbiota intestinal y cerebral, se han implementado probióticos productores de GABA en alimentos fermentados. Las cepas de Lactiplantibacillus plantarum SKKL1, SKKP1 y NBK10 son probióticos productores de GABA que se aislaron de alimentos fermentados tradicionales tailandeses6. Sin embargo, la fermentación del yogur utilizando L. plantarum ha enfrentado obstáculos ya que esta bacteria se considera un inóculo no lácteo que no puede crecer eficazmente en la leche7,8,9. Además, de acuerdo con la regulación de la administración de alimentos y medicamentos en Tailandia, se requiere que Streptococcus thermophilus y L. bulgaricus se utilicen como iniciador de cocultivo para la producción de yogur. Como resultado, limita los estudios sobre los metabolitos bacterianos y la producción de L. plantarum como única bacteria. No se ha publicado ningún estudio exhaustivo que investigue los factores que obstaculizan el uso de L. plantarum como cultivo puro para leche fermentada, ya que muchos estudios sugieren fabricar yogur cocultivando L. plantarum con otras bacterias del ácido láctico como S. thermophilus y L. bulgaricus10,11,12.

Generalmente, la leche es una fuente rica en nutrientes de proteínas y carbono, que son componentes esenciales para el metabolismo y el crecimiento bacteriano, lo que la convierte en un sustrato ideal para muchas cepas de bacterias. Además, la leche bovina suele ser un buen sustrato para la biosíntesis de GABA porque contiene aproximadamente 9,07 mg/100 g de ácido glutámico libre13 y hasta 0,52 mg/L de vitamina B614. Como resultado, podría no ser necesaria la adición suplementaria de glutamato monosódico a la leche, especialmente para la producción de alimentos funcionales que contienen GABA. Los hallazgos del presente estudio contribuirán como un aspecto de la evidencia que respalda la hipótesis de que el consumo de probióticos productores de GABA podría establecer bacterias productoras de GABA en la microbiota intestinal. Esto proporcionaría GABA a un individuo sin la necesidad de consumir alimentos probióticos que contengan GABA. De esta manera, GABA se produciría y estaría disponible continuamente.

Por lo tanto, para determinar los principales obstáculos para la producción de leche fermentada rica en GABA por parte de L. plantarum, se evaluaron varias cepas de esta bacteria, SKKL1, SKKP1 y NBK10. Se investigó el tipo de leche bovina y los parámetros de fermentación. Se examinaron los efectos de la adición de azúcar, proteínas y enzimas proteasas. Se llevó a cabo un examen de la capacidad de dichas bacterias para producir GABA en medios a base de leche.

Se aislaron L. plantarum SKKL1, SKKP1 y NBK10 de alimentos fermentados tradicionales tailandeses y se caracterizaron sus propiedades probióticas. Se examinó la tolerancia al pH bajo, las sales biliares y la susceptibilidad a los antibióticos6,15. Estas bacterias probióticas crecieron considerablemente y produjeron GABA en MRS que contenía glutamato monosódico. Independientemente de qué tan bien crezcan las bacterias en los medios MRS, su crecimiento en la leche no cumplió con las expectativas.

Se comparó la producción de leche bovina entera y descremada para la producción de leche fermentada. Teniendo en cuenta la composición de la leche, doscientos mililitros de leche entera contenían 8 g de grasa, 25 mg de colesterol, 6 g de proteína, 10 g de carbohidratos y 85 mg de sodio. Por el contrario, la leche desnatada contenía 0 g de grasa, menos de 5 mg de colesterol, 7 g de proteína, 11 g de carbohidratos y 100 mg de sodio. La principal diferencia entre la leche entera y la descremada es su contenido de grasa y colesterol.

Los resultados mostraron que después de 48 h de fermentación en leche entera y descremada, el número de células viables alcanzó aproximadamente 10 log (UFC/mL), pero el pH aún era superior al criterio del yogur de 4,616, como se muestra en la Tabla 1. Así , L. plantarum no era adecuado como iniciador de cultivo puro para la elaboración de yogur. Muchos estudios sugirieron que el contenido de grasa en la leche es uno de los factores cruciales que afectan las características de sabor, gusto y textura del yogur, como la dureza, la elasticidad y la sinéresis, más que la actividad de las bacterias17,18. El yogur es reconocido como uno de los productos fermentados más consumidos a nivel mundial. Por lo tanto, utilizar leche fermentada es una de las mejores formas de introducir bacterias productoras de GABA en la dieta. Se encontró una fermentación lenta en la cepa NBK10. Se pudo alcanzar un pH de 4,3, lo que aseguró la cuajada del yogur. Sin embargo, utilizar 72 h para la producción de yogur es ineficiente ya que requeriría altos costos operativos en la producción a escala comercial. Por tanto, aumentar la temperatura de fermentación podría acelerar el metabolismo de las células bacterianas durante la fermentación.

La temperatura de fermentación se fijó originalmente en 30 °C, en la que L. plantarum podía crecer lentamente durante el período de fermentación. Sin embargo, esta condición no se pudo utilizar para preparar leche cuajada debido a que no se pudo obtener un valor de pH inferior a 4,6, como se muestra en la Fig. 1B. Cuando la temperatura se aumentó a 40 °C, las células bacterianas se inactivaron y se observó una disminución en el número de células viables (Fig. 1A). Esto concuerda con el estudio de Shan et al.19 quienes informaron que las células viables de L. plantarum NDC75017 disminuyeron con la incubación a 35 °C y luego se inactivaron completamente a 45 °C. Como resultado, el estudio actual se realizó a 30 °C.

Curva de crecimiento de L. plantarum SKKL1, SKKP1 y NBK10 en un medio de leche entera a 30 °C y 40 \(^\circ\)C (A), y valores de pH resultantes (B).

Otros estudios sugirieron el uso de otro iniciador de cultivo a alta temperatura para crear condiciones ácidas en la leche y la posterior formación de cuajada, seguido de la inoculación de L. plantarum para una mejora nutricional y sensorial. Jouki et al. utilizaron un método de dos pasos para hacer yogur: primero fermentaron la leche con S. thermophilus y L. bulgaricus a una temperatura más alta para lograr un pH bajo de 4,5, y luego agregaron L. plantarum10. Zhang et al. emplearon iniciadores de cocultivo utilizando S. thermophilus, L. bulgaricus y L. plantarum WCFS1 a 42 °C durante 12 h para la producción de yogur bajo en azúcar12. La investigación de Sidira et al. También se realizó con iniciadores mixtos para la producción de yogurt11. Como resultado, se ve que L. plantarum no es un probiótico ideal para la producción de yogur por sí solo. Sin embargo, ningún informe explica por qué L. plantarum produjo concentraciones de ácido muy bajas en la fermentación de la leche. Por lo tanto, la composición de los medios fue un foco adicional. Solo se seleccionó la cepa SKKL1 para futuras investigaciones, debido a su caracterización exhaustiva y aplicación exitosa como probiótico potencial para productos fermentados en otros estudios (datos no publicados).

Los hallazgos demuestran que los recuentos de células viables mediante la adición de glucosa y lactosa no fueron significativamente diferentes a los de la leche sin adición de azúcar (Fig. 2A). La leche fermentada que contenía glucosa y lactosa se caracterizó por un valor de pH más bajo en comparación con la leche sin azúcar añadido, pero después de 48 h de fermentación (Fig. 2B). El contenido de azúcar resultante (Tabla 2) y el patrón de azúcar por TLC (Fig. 2C) muestran un bajo consumo de azúcar correspondiente a un crecimiento deficiente por parte de la cepa SKKL1. La glucosa y la lactosa se mantuvieron en sus niveles iniciales en todas las muestras de leche. Curiosamente, la cepa SKKL1 no consumió glucosa mientras crecía en leche. La glucosa es el monosacárido más utilizado por las bacterias del ácido láctico. Por el contrario, otros estudios confirman que L. plantarum, incluida la cepa SKKL1, consumió efectivamente lactosa en medio MRS modificado debido a un gen que codifica la β-galactosidasa20,21 para producir una gran cantidad de ácido láctico12. Debería haber otro factor limitante en la fermentación de la leche que restrinja la absorción de azúcar por parte de esta bacteria. Esto se debe a que cuando se modificó la composición del medio (de MRS a leche bovina), el consumo de azúcar de las bacterias cambió notablemente. Se convirtió en una bacteria viable pero no cultivable, similar a una que había estado expuesta a estrés ambiental como privación de nutrientes, calor, estrés osmótico y pH bajo.

Efecto de la glucosa y la lactosa sobre las propiedades de la leche fermentada (A) células viables, (B) pH y (C) patrón de azúcar en una placa de cromatografía de capa fina (TLC) con glucosa (GLC) y lactosa (LAC) como marcadores estándar durante la fermentación por L. plantarum SKKL1 a 30 \(^\circ\)C durante 48 h.

El factor que impide el consumo de azúcar y el metabolismo bacteriano podría ser una fuente inadecuada de nitrógeno para el crecimiento celular. Los resultados mostraron que la adición de extracto de levadura o extracto de malta podría mejorar significativamente el crecimiento bacteriano en comparación con una fermentación de leche a la que no se agregó proteína (Fig. 3A). El pH de las muestras de leche a las que se añadió extracto de levadura o extracto de malta finalmente alcanzó 4,5 y 4,3 dentro de las 24 h posteriores a la fermentación, lo que se requiere para la producción de yogur (Fig. 3B) y proporcionó la formación de cuajada. Estos resultados concuerdan con el estudio de Li et al.22. Se observó actividad coagulante de la leche por parte de L. plantarum en la leche a la que se añadió extracto de levadura. Alternativamente, la muestra de leche sin adición de proteínas permaneció en estado neutro durante toda la fermentación, con un pH de 6,01.

Efecto del extracto de levadura y del extracto de malta sobre las propiedades de la leche fermentada (A) células viables, (B) pH durante la fermentación por L. plantarum SKKL1 a 30 \(^\circ\)C durante 48 h.

El contenido cambiante de azúcar reductor confirmó que las bacterias crecieron notablemente mejor que cuando no se agregó proteína. Esto se evidencia por la disminución del contenido de azúcar, de 52 g/L y 59 g/L a 33 g/L y 34 g/L para las muestras de leche suplementadas con extracto de levadura y extracto de malta, respectivamente. Mientras que las muestras de leche sin proteína agregada no mostraron utilización de azúcar al final de la fermentación (Tabla 2). La absorción de azúcar y su metabolismo comienzan cuando las bacterias tienen una fuente de proteínas adecuada. Este hallazgo indica que la cepa SKKL1 no podía consumir azúcar sin una suplementación proteica adecuada. Anteriormente se informó que la cepa SKKL1 no crecía en MRS sin azúcar a menos que se le proporcionara glucosa23.

Por lo tanto, el examen de las diversas fuentes de proteína del extracto de levadura, el extracto de malta y la leche bovina se centró en los contenidos de proteína soluble24, que fueron 303,9 mg/extracto de levadura, 96,2 mg/g de extracto de malta y 25,7 mg/g de leche en polvo, respectivamente. El extracto de levadura contenía moléculas solubles en agua liberadas después de la alteración de las células de levadura. Los péptidos solubles fueron el componente principal, que representaron el 50% de la masa total de levadura, dependiendo de los métodos de lisis y recuperación celular25, seguidos de los aminoácidos libres, los minerales y la vitamina B626. Además, las proteínas de origen vegetal, como el extracto de malta, son productos solubles que se obtienen de la malta durante el macerado. Contiene una fracción mayoritaria de disacáridos, con proteínas, aminoácidos, fibra soluble y vitamina B327,28. Por el contrario, la leche bovina generalmente se reconoce como una fuente rica en proteínas, pero contiene niveles muy bajos de proteína soluble en comparación con el extracto de levadura y el extracto de malta. La mayoría de las proteínas de la leche son caseína intacta29, lo que requiere una proteasa eficaz para hidrolizar este complejo en pequeñas moléculas o péptidos. Para encontrar el factor real involucrado en la hidrólisis de proteínas durante la fermentación de la leche por SKKL1, se investigaron más a fondo la detección de proteasas y la influencia de la proteasa activa durante la fermentación de la leche.

La proteína soluble puede ser un factor clave necesario para estimular el consumo de azúcar para el crecimiento y el metabolismo bacteriano. Se analizó la capacidad de producción de proteasa de L. plantarum SKKL1. Estos resultados indican que la cepa SKKL1 no pudo producir proteasas extracelulares, intracelulares o de envoltura celular (datos no mostrados). Así, el factor que impide la fermentación de la leche por parte de la cepa SKKL1 podría ser la falta de proteasas que degradan la caseína. Para confirmar esta hipótesis, se esperaba que el crecimiento de la cepa SKKL1 en la leche aumentara en niveles más altos cuando se proporcionaba proteasa suplementaria.

El efecto de la adición de proteasa sobre las propiedades de la leche fermentada se muestra en la Fig. 4. La adición de una enzima proteasa cruda podría hidrolizar la caseína en la leche y liberar 15,18 g/L y 15,55 g/L de proteína soluble después de 24 h y 48 h, respectivamente. Estos fueron aproximadamente cuatro veces más altos que el nivel de proteína soluble observado cuando las muestras de leche se suplementaron con proteasa inactivada (Fig. 4B). La acción de la proteasa no sólo aumenta el contenido de proteína soluble, sino que otros componentes de las soluciones de enzimas tanto activadas como inactivadas también aumentan el contenido de proteína soluble. Se obtuvo una enzima proteasa a partir de la fermentación de soja mediante B. subtilis J12, que originalmente contenía proteína de soja hidrolizada. Por lo tanto, la proteasa activa añadida a la leche contenía tres tipos diferentes de proteínas: caseína intacta, caseína hidrolizada y péptidos de soja hidrolizados. La proteasa inactivada añadida a la leche sólo mostró caseína intacta y péptidos de soja hidrolizados.

Efecto de la adición de proteasa sobre las propiedades de la leche fermentada (A) células viables, (B) el contenido de proteína soluble, (C) pH y (D) estructura similar a la cuajada de la leche fermentada a 30 \(^\circ\)C durante 24 h.

Los resultados mostraron que sólo la leche a la que se añadió proteasa inactivada mostró un ligero consumo de proteínas ya que disminuyó de 3,91 g/L (0 h) a 2,93 g/L después de 48 h. La leche a la que se añadió proteasa activa proporcionó mayores contenidos de proteína soluble durante la fermentación. Sin embargo, el crecimiento bacteriano en muestras de leche que contenían proteasa activa y proteasa inactiva no fue significativamente diferente. Aumentaron de 7,20 log UFC (0 h) a 8,59 log UFC después de 24 h, como se muestra en la Fig. 4A. Este hallazgo indica que los péptidos solubles liberados de la proteína caseína mediante hidrólisis enzimática (9,44 g/L) no pudieron mejorar el crecimiento bacteriano a niveles superiores al contenido de proteína de la proteasa inactivada (1,47 g/L). Las células viables de ambas muestras eran casi iguales a las 0, 24 y 48 h, como se ve en la Fig. 4A. Sorprendentemente, el aumento en el crecimiento bacteriano se derivó del contenido de proteínas de las proteasas (formas activadas e inactivadas) agregadas a las muestras de leche. Los péptidos solubles liberados por la hidrólisis de la caseína no favorecen el metabolismo bacteriano.

Los valores de pH de las muestras de leche a las que se añadió proteasa activa fueron ligeramente más bajos que los de las muestras de leche suplementadas con proteasa inactivada (Fig. 4C). Esto se debe al aumento del contenido de aminoácidos libres durante la hidrólisis enzimática, como lo indica el contenido de ácido glutámico en la Tabla 2. Sólo las muestras de leche a las que se añadió proteasa cumplieron con los criterios del yogur de alcanzar un pH de 4,6 después de 48 h de fermentación.

El consumo selectivo de proteínas de la cepa SKKL1 podría verse influenciado por una deficiencia de proteasa dirigida a la caseína. Las cepas no lácteas, como SKKL1, consumen preferentemente proteínas simples, como proteínas vegetales, en lugar de proteínas complejas como la caseína o el hidrolizado de caseína. Se podría deducir que una proteína de caseína procedente de animales podría ser problemática en el metabolismo microbiano en comparación con las proteínas de origen vegetal, como las proteínas de soja y el extracto de malta.

Se determinó el contenido de GABA y glutamato en leche fermentada utilizando la cepa SKKL1. Los resultados mostraron que el GABA se podía encontrar en la leche fermentada en 65,72 mg/L y 17,62 mg/L con la respectiva adición de extracto de levadura y proteasa, como se muestra en la Tabla 2. El contenido inicial de ácido glutámico en la leche a la que se añadió extracto de levadura alcanzó 2.088,63 mg/L, superior al de otras muestras. Disminuyó a 1.873,89 mg/L después de 48 h de fermentación. Sin embargo, el extracto de levadura contiene inicialmente 4,19 mg/extracto de levadura de GABA y 158,2 mg/extracto de levadura de glutamato, así como vitamina B6 que actúa como coenzima para la síntesis de GABA26.

Para las muestras de leche fermentada a las que se añadió proteasa, se encontró que el contenido de GABA era de 17,62 mg/L. Durante la hidrólisis enzimática y la fermentación simultáneas de muestras de leche a las que se añadió proteasa, después de 0, 24 y 48 h, el contenido de ácido glutámico aumentó de 166,80 mg/L a 341,86 mg/L y 356,28 mg/L, respectivamente. Sin embargo, al considerar muestras de leche a las que se añadió proteasa inactivada, se descubrió que una pequeña cantidad de proteína de soja podría favorecer el crecimiento de la cepa SKKL1, pero el contenido de ácido glutámico (180 mg/L) era insuficiente para promover la producción de GABA.

Alternativamente, las muestras de leche fermentada a las que se añadió extracto de malta no contenían GABA, aunque el crecimiento de la cepa SKKL1 y el pH fueron similares a las muestras suplementadas con extracto de levadura. El extracto de malta contiene ácido glutámico libre (48,23 mg/extracto de malta) y niveles muy bajos de vitamina B6, que pueden ser inadecuados para la activación del GAD.

Cuando a la cepa SKKL1 se le suministraron altas cantidades de glutamato y vitamina B6 en condiciones de pH bajo, se activó la glutamato descarboxilasa (GAD) para mantener su supervivencia en condiciones ácidas. El sistema de descarboxilación de glutamato neutraliza las condiciones ácidas en entornos intra y extracelulares descarboxilando un sustrato ácido en un compuesto neutro (ácido glutámico, pI 3,08 a ácido γ-aminobutírico, pI 7,30) y luego liberando CO230. Posteriormente se libera GABA, lo que da como resultado la alcalinización del ambiente ácido. Como resultado, se observó un aumento de 2,6 veces en el contenido de GABA en muestras de leche fermentada suplementadas con extracto de levadura durante un período de 24 a 48 h en las que existía una condición ácida. De ahí que se puede deducir que la cantidad de ácido glutámico, vitamina B6, glutamato descarboxilasa y condiciones ambientales favorables, son fundamentales para la producción de GABA.

Los productos lácteos ricos en GABA son alimentos funcionales de moda basados en el concepto del eje intestino-cerebro. Numerosos estudios intentaron producir probióticos potenciales con la adición directa de glutamato monosódico y abordar el crecimiento ineficaz de L. plantarum en la leche durante una fermentación de cocultivo con otras bacterias del ácido láctico. Este estudio muestra que un cultivo puro de L. plantarum SKKL1 puede crecer y producir ácido láctico proporcionando una proteína soluble adecuada. Sin embargo, el metabolismo para producir GABA fue una sinergia del ácido glutámico derivado del extracto de levadura o del hidrolizado de proteasa adecuado y condiciones ácidas durante el proceso de fermentación. E incluso si L. plantarum actualmente no está en la lista de probióticos aprobados para la producción de yogur, este estudio muestra que L. plantarum podría ser un nuevo candidato prometedor para la producción de yogur en el futuro. Para conocer mejor el comportamiento metabólico de L. plantarum, el trabajo actual propone un enfoque para la biosíntesis de GABA en leche fermentada sin adición de glutamato monosódico. Este producto lácteo rico en GABA contiene probióticos productores de GABA y GABA que pueden ayudar en la producción continua de GABA bajo el eje intestino-cerebro.

L. plantarum SKKL1, SKKP1 y NBK10 se cultivaron en caldo De Man, Rogosa y Sharpe (MRS) de HIMEDIA (que consta de 1,0 % (p/v) de peptona proteasa, 1,0 % (p/v) de peptona B HM, 0,5 % (p/v) extracto de levadura, 2,0 % (p/v) glucosa, 0,5 % (p/v) acetato de sodio, 0,5 % (v/v) polisorbato 80, 0,2 % (p/v) hidrogenofosfato dipotásico, 0,2 % (p/v) citrato de amonio, 0,02 % (p/v) sulfato de magnesio heptahidratado, 0,005 % (p/v) sulfato de manganeso tetrahidratado) con 5 % (p/v) glutamato monosódico) a 30 °C durante 24 h. Las células bacterianas se volvieron a cultivar a las 18 hy luego se recogieron mediante centrifugación (6750 xg durante 5 min). El sedimento celular se lavó dos veces con solución salina normal. La turbidez de las células activas en solución salina normal se ajustó para obtener un tamaño de inóculo de 108 UFC/mL. Se obtuvo proteasa a un nivel de 50 U/mL de Bacillus subtilis J12 en harina de soja mediante fermentación en estado sólido a 37 \(^\circ\)C durante 24 h. Se preparó proteasa inactivada por calor para su uso en un cultivo de control.

La leche bovina pasteurizada comercialmente se produce generalmente como leche entera y leche desnatada. Ambos tipos de leche se calentaron a 60 °C durante 30 min y se enfriaron a 25 °C antes de la inoculación con 10% (v/v) de la solución celular. La fermentación de la leche se realizó a 30 °C durante 72 h. Además, se realizó una comparación de las temperaturas de fermentación de 30 °C y 40 °C. Los efectos de varios azúcares se examinaron mediante la suplementación con lactosa y glucosa en una concentración del 2% (p/v) en la leche, por separado. Los efectos de las proteínas se examinaron añadiendo 1% (p/v) de extracto de levadura y extracto de malta22, por separado, a la leche. Los efectos de los azúcares y las proteínas en la fermentación de la leche se realizaron a 30 °C durante 48 h. El recuento de células viables, el pH, el contenido de GABA, el contenido de azúcar y el contenido de proteínas solubles se controlaron a las 0, 24 y 48 h.

La proteasa y la proteasa inactivada de Bacillus subtilis J12 se agregaron a la leche tibia en una proporción de enzima a sustrato (E:S) del 5% (v/v). Luego, se realizó la fermentación de la leche agregando 10% (v/v) de la solución celular e incubando a 30 °C durante 48 h. El recuento de células viables, el pH, el contenido de GABA, el contenido de azúcar y el contenido de proteínas solubles se controlaron a las 0, 24 y 48 h.

Las bacterias se inocularon en caldo MRS y luego se incubaron a 30 °C durante 24 h. Las enzimas extracelulares en el sobrenadante libre de células se obtuvieron después de centrifugación a 6750 g(x) durante 5 min. Las células del sedimento se lisaron en un baño de ultrasonidos. Se usó tampón PBS (pH 7) para lavar las enzimas intracelulares. Se examinaron las enzimas extra e intracelulares, así como las enzimas de la envoltura celular, para determinar la actividad de la proteasa31.

Las muestras se diluyeron diez veces con solución salina normal estéril al 0,85% (p/v). Se colocaron diez microlitros de muestras diluidas en agar MRS y luego se incubaron a 30 °C durante 48 h. Las colonias se contaron y se informaron como log (UFC/mL)32.

El pH de las muestras se determinó utilizando un medidor de pH.

Se desarrolló un patrón de azúcar cualitativo colocando 2 µl de muestra en una placa de cromatografía en capa fina (TLC) usando gel de sílice 60 F254 (Merck, EE. UU.). Las manchas en la placa se secaron completamente antes del movimiento de la fase móvil. La fase móvil se preparó como una solución de butanol: isopropanol: etanol: agua desionizada en una proporción de 2:3:3:2. Posteriormente, las placas de TLC se sumergieron en un reactivo de detección de manchas preparado disolviendo orcinol al 2% (p/v) en ácido sulfúrico al 1% (v/v) en etanol. Las placas de TLC se calentaron en una estufa a 90 °C durante 10 min. Luego, se observaron los colores de las manchas. Se utilizaron glucosa y lactosa como marcadores estándar33. El contenido de glucosa se cuantificó mediante el método GOD-POD34. El contenido de azúcares reductores se evaluó mediante el método DNS35.

La leche fermentada se purificó parcialmente usando CH3COOH glacial al 0,4% (v/v), en una proporción de muestra:ácido 1:1 durante 12 h a 4 °C, para precipitar las proteínas de caseína intactas. El sobrenadante claro obtenido después de la centrifugación se filtró a través de un filtro de jeringa de 0,45 µm. Posteriormente, se analizó la concentración de GABA mediante HPLC. Brevemente, se utilizó una bomba binaria LC-20A (Shimadzu, Japón) con un conjunto de columnas Inersil ODS-3: (4,6 × 250 mm, 5 μm) en un horno (CTO-20A) a 40 °C. La muestra se analizó utilizando un detector de fluorescencia con una excitación de 350 nm, una emisión de 450 nm, una ganancia de × 4, una celda de flujo de 5 µl y baja sensibilidad36. La fase móvil fue NaH2PO4·2H2O, Na-P-toluenosulfonato, agua desionizada y etanol absoluto. La solución de detección de aminoácidos era un reactivo de ortoftalaldehído (OPA) que contenía OPA etanólico y N-acetil-l-cisteína en un tampón de borato. El sistema se hizo funcionar a un caudal de 0,5 ml/min de tampón y 0,2 ml/min de reactivo OPA. Además, el sobrenadante claro obtenido después de la precipitación se utilizó para determinar los niveles de proteína soluble siguiendo el método de Lowry24.

Se incubaron cincuenta microlitros de la enzima con 350 µl de caseína al 1% (p/v) en un tampón PBS 0,1 M, pH 7, a 37 °C durante 10 minutos. La actividad enzimática se detuvo añadiendo 1000 µl de solución de ácido tricloroacético al 10% (p/v). Se tomó una muestra del sobrenadante claro para la determinación de proteínas. Se preparó un control mezclando 350 µl de subestado con 1000 µl de una solución de ácido tricloroacético al 10 % (p/v) y luego añadiendo 50 µl de una solución enzimática. El aumento del contenido de proteínas representa actividad proteasa (modificado de 37).

La correspondencia y las solicitudes de materiales deben dirigirse a JA

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Este trabajo fue apoyado por el Fondo Nacional de Ciencia, Investigación e Innovación (NSRF) a través del Fondo Fundamental de la Universidad de Khon Kaen, Tailandia.

Departamento de Biotecnología, Facultad de Tecnología, Universidad de Khon Kaen, Khon Kaen, 40002, Tailandia

Konlarat Phirom-on, Anuchida Po-ngern, Somchai Jaikhan, Sasiwan Sirichon, Sukanda Vichitphan, Kanit Vichitphan y Jirawan Apiraksakorn

Centro de Investigación sobre Fermentación para Productos Agrícolas de Valor Agregado (FerVAAP), Universidad de Khon Kaen, Khon Kaen, Tailandia

Sukanda Vichitphan, Kanit Vichitphan y Jirawan Apiraksakorn

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KP y AP concibieron las ideas, diseñaron y realizaron los experimentos, analizaron los datos, prepararon y revisaron el manuscrito. SJ y SS realizaron los experimentos y analizaron los datos. SV y KV concibieron las ideas y analizaron los datos. JA concibió las ideas, diseñó los experimentos, analizó los datos, preparó, revisó y envió el manuscrito, realizó la administración del proyecto y la adquisición de fondos. Todos los autores leyeron y aprobaron la versión final del manuscrito.

Correspondencia a Jirawan Apiraksakorn.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Recibido: 15 de mayo de 2023

Aceptado: 13 de julio de 2023

Publicado: 15 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38701-w

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