Identificación de consumidores de glucanos en muestras de microbiota intestinal humana mediante etiquetado metabólico junto con fluorescencia

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 662 (2023) Citar este artículo

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La composición y el metabolismo de la microbiota intestinal humana están fuertemente influenciados por los glicanos complejos de la dieta, que provocan efectos posteriores en la fisiología y la salud de los huéspedes. A pesar de los avances recientes en nuestra comprensión del metabolismo de los glicanos por parte de las bacterias intestinales humanas, todavía necesitamos métodos para vincular los glicanos con las bacterias que los consumen. Aquí utilizamos un ensayo funcional para identificar y aislar bacterias intestinales de voluntarios humanos sanos que absorben diferentes glicanos. El método combina el etiquetado metabólico utilizando oligosacáridos fluorescentes con clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), seguido de secuenciación de amplicones o culturómica. Nuestros resultados demuestran el etiquetado metabólico en varios taxones, como Prevotella copri, Collinsella aerofaciens y Blautia wexlerae. La validación in vitro confirma la capacidad de la mayoría, pero no de todas, las especies marcadas de consumir el glicano de interés para el crecimiento. Paralelamente, mostramos que los consumidores de glucanos que abarcan tres filos principales pueden aislarse de cultivos de células marcadas clasificadas. Al vincular las bacterias con los glicanos que consumen, este enfoque aumenta nuestra comprensión básica del metabolismo de los glicanos por parte de las bacterias intestinales. En el futuro, podría utilizarse para proporcionar información sobre el mecanismo de los enfoques prebióticos, en los que se utilizan glicanos para manipular la composición de la microbiota intestinal.

La microbiota intestinal es parte integral de la fisiología humana, ya que metaboliza nuestra dieta, sintetiza vitaminas y aminoácidos esenciales, entrena el sistema inmunológico y nos protege de patógenos1,2,3,4,5. Los avances en herramientas genéticas y bioinformáticas han llevado a una nueva comprensión de la complejidad y diversidad de la microbiota intestinal, así como de su importancia en las enfermedades humanas6. El microbioma intestinal está enriquecido con genes implicados en la glucólisis y el metabolismo de los carbohidratos2,7. A través de estas enzimas activas sobre carbohidratos (CAZimas), las bacterias intestinales metabolizan los glicanos complejos (fibras dietéticas) derivados de la dieta que llegan al colon sin ser digeridos por el huésped8,9. En consecuencia, la dieta es un determinante importante de la composición y diversidad de la microbiota intestinal, más que los factores genéticos10. De hecho, los cambios en la dieta suelen dar como resultado rápidas modificaciones metabólicas microbianas y una estructura de la comunidad microbiana alterada7,11. Es importante destacar que incluso diferencias estructurales sutiles en los glicanos pueden producir resultados metabólicos microbianos distintos en estudios de suplementación en humanos12.

Nuestra comprensión de las CAZymes está avanzando rápidamente, como lo ejemplifica la caracterización de los loci de utilización de polisacáridos (PUL) en Bacteroidetes, como el sistema de utilización de almidón (SUS) ampliamente estudiado en Bacteroides thetaiotaomicron13. El locus Sus codifica proteínas responsables de la unión (SusDEF) y la degradación de la superficie celular (SusG) de los polisacáridos del almidón en oligosacáridos que son transportados al periplasma por el transportador SusC dependiente de TonB, donde son procesados ​​posteriormente en monosacáridos por las glucósidos hidrolasas. GH) SusAB14. De manera similar, se han descrito PUL específicos para muchos otros glicanos, como manano, β-glucano, xiloglucano y galactomanano15,16,17,18,19. Por otro lado, las bacterias Gram positivas contienen transportadores que pueden internalizar estructuras de oligosacáridos como los fructooligosacáridos (FOS) mediante el MsmEFGK de cuatro componentes en Lactobacillus acidophilus20, o los β-mananos mediante una proteína fijadora de solutos (MnBP) y dos permeasas (MPP). en Roseburia intestinalis21. A pesar de estos avances, muchos PUL todavía tienen especificidades de sustrato desconocidas y las familias de GH pueden tener múltiples sustratos, lo que dificulta predecir la actividad basándose en la secuenciación9,13,22,23,24. Por lo tanto, son necesarios métodos funcionales que vinculen los glicanos con sus consumidores primarios, especialmente para Firmicutes y otros miembros menos estudiados de la microbiota intestinal humana25.

Se han desarrollado varios métodos para abordar esta necesidad, con distintos niveles de complejidad, y se han resumido en excelentes revisiones que se centran en el etiquetado metabólico de membrana26 o en la ingeniería de oligosacáridos metabólicos27,28. Como una de las primeras técnicas desarrolladas, el sondeo de isótopos estables (SIP) es un método laborioso pero poderoso para seguir el metabolismo e identificar a los consumidores que se aplicó al metabolismo del almidón y galactooligosacáridos en sistemas de fermentación29,30,31. Sin embargo, SIP generalmente requiere crecimiento bacteriano para el etiquetado, lo que induce sesgos en los medios bacterianos. Recientemente, Patnode y sus colegas utilizaron análisis genético avanzado, metaproteómica cuantitativa y partículas de alimentos artificiales para investigar la degradación de la fibra en ratones colonizados con comunidades sintéticas de bacterias intestinales32. Este enfoque reveló la contribución de las especies de Bacteroides al procesamiento de glicanos específicos y destacó la competencia entre especies. Más recientemente, los mismos investigadores utilizaron perlas cubiertas de glicano para examinar la adhesión de bacterias a polisacáridos y revelaron diferencias en la especificidad a nivel de cepa33. En particular, utilizaron perlas magnéticas para recuperar e identificar bacterias adherentes de un cocultivo bacteriano e insinuaron la posibilidad de utilizar este método para extraer consumidores previamente no caracterizados33. Sin embargo, es importante señalar que estos enfoques aún deben validarse en comunidades naturales más complejas.

Los enfoques de fisiología de próxima generación que combinan el fenotipado celular no destructivo con la separación de células proporcionan un marco poderoso para estudiar la fisiología y el metabolismo microbianos27. La clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) junto con la secuenciación (FACSeq) es particularmente eficiente y puede revelar la fisiología de células individuales dentro de comunidades bacterianas complejas, lo que permite la identificación de bacterias marcadas según su contenido relativo de ácido nucleico, integridad de la membrana celular y metabolismo sin cultivo previo34,35,36,37. El método FACSeq se puede aplicar en diversos contextos, como la identificación de taxones de microbiota intestinal asociados con la inmunoglobulina A o el colesterol38,39. Recientemente se utilizaron glicanos fluorescentes para demostrar la absorción de oligosacáridos de α-manano en el periplasma de B. thetaiotaomicron mediante microscopía de epifluorescencia y FACS40, mientras que otro estudio reveló el papel de Verrucomicrobia no cultivada en la degradación de polisacáridos en sistemas acuáticos utilizando glicanos marcados con fluorescencia, FACS y genómica unicelular41. Más recientemente, Doud y sus colegas utilizaron partículas de celulosa marcadas con fluorescencia, FACS y secuenciación de amplicones para descubrir bacterias que degradan la celulosa en manantiales geotérmicos42. En conjunto, estos estudios resaltan el potencial de combinar enfoques independientes del cultivo para vincular la diversidad bacteriana con el metabolismo específico.

Aquí, utilizamos el etiquetado metabólico acoplado a FACS y la secuenciación del amplicón 16S rDNA para revelar la absorción bacteriana de tres oligosacáridos estructuralmente diferentes en las heces de tres voluntarios sanos no relacionados. Las células de glucano+ clasificadas se enriquecieron en recolectores de glucano del filo Bacteroidetes, pero también en Firmicutes y Actinobacteria, como Blautia wexlerae y Collinsella aerofaciens, respectivamente. Se confirmó que la mayoría de las bacterias marcadas significativamente eran consumidoras de glucanos para el crecimiento y codificaban GH con actividad consistente con los glucanos utilizados, pero pudimos identificar a B. wexlerea como un consumidor de FOS no informado previamente. Sin embargo, tres especies de Bacteroidetes marcadas con un glicano fluorescente no mostraron un fenotipo de crecimiento in vitro con este glicano. Paralelamente, aislamos consumidores bacterianos de glucano que pertenecían a tres filos diferentes en una muestra de microbiota humana mediante el cultivo de células glucano+. Si bien este método no etiqueta las bacterias implicadas en la alimentación cruzada, es un método útil para identificar a los consumidores de oligosacáridos.

Para investigar la absorción de glicanos fluorescentes en las bacterias intestinales, primero sintetizamos un conjugado de fluoresceína de β-ciclodextrina, que imita la estructura helicoidal del almidón, uno de los polisacáridos más comunes en nuestra dieta, y se ha utilizado para la caracterización estructural de B. .thetaiotaomicron SUS43. El conjugado monofuncionalizado (CD-F (1), Fig. 1a) se purificó mediante HPLC preparativa y se caracterizó por espectrometría de masas (MS). La absorción específica de CD-F se investigó por primera vez en Klebsiella oxytoca, una bacteria intestinal del filo Proteobacteria que alberga el transportador CymA específico para ciclodextrina44. La cepa M5A1 de K. oxytoca se cultivó en medio mínimo M9 (MM M9) suplementado con β-ciclodextrina al 0,1%. Las bacterias en la fase logarítmica que se incubaron con CD-F mostraron un aumento significativo de la fluorescencia en comparación con el control negativo (Fig. 1d), lo que se corroboró mediante microscopía de fluorescencia (Fig. 1e) y citometría de flujo (Fig. S1a).

a – c Síntesis de sondas fluorescentes de β-ciclodextrina (a), nistosa (b) y galactosil-manopentaosa (c). Los glicanos monofuncionalizados se purificaron mediante cromatografía de fase inversa, cromatografía de exclusión por tamaño o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Los productos se caracterizaron por espectrometría de masas. d Fluorescencia medida a partir de cultivos lavados de K. oxytoca (Proteobacteria) y L. acidophilus (Firmicutes) después de la incubación en sus respectivos medios mínimos con sonda CD-F o NYST-F durante 30 minutos, medida en un espectrofluorómetro. Los datos son la media ± DE (n = 3). Significancia estadística en comparación con la condición de control mediante pruebas t no apareadas con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni-Dunn. e Imagen de microscopía confocal de K. oxytoca marcada con fluorescencia e imagen de microscopía de 2 fotones de L. acidophilus después de la incubación con CD-F y NYST-F. Las bacterias en fase exponencial se lavaron e incubaron durante 1 h con las sondas (500 nM) y luego se fijaron con paraformaldehído al 4%. f Cuantificación de fluorescencia de bacterias aisladas de muestras de heces después de la incubación con fluoresceína libre (4,4 μM) o CD-F (4,4 μM) durante 1 h con o sin pretratamiento de choque térmico de la microbiota intestinal durante 10 min a 65 °C. Los datos son la media ± DE (n = 3). Significancia estadística comparada con la condición etiquetada mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Los datos de origen y los detalles estadísticos se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego preparamos nistosa marcada con fluorescencia (NYST-F (2), Fig. 1b), un tetrasacárido derivado de la inulina, que es un prebiótico de fructano común que se encuentra en el trigo, la cebolla y el plátano (Fig. 1b)45. Se realizó una funcionalización no selectiva de los grupos hidroxilo de la nistosa para obtener una mezcla de nistosas monofuncionalizadas que se conjugaron en diferentes posiciones. Esto es importante ya que no conocemos el supuesto motivo de reconocimiento del transportador y es menos probable que una mezcla de conjugados interfiera con la unión. Por lo tanto, la purificación de nistosa fluorescente (NYST-F) produjo una mezcla de productos con pesos moleculares idénticos que correspondían al glicano monofuncionalizado mediante cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC‒MS). Se cultivaron cultivos del consumidor conocido L. acidophilus (cepa ATCC 4356) en caldo personalizado De Man, Rogosa, Sharpe (cMRS) sin glucosa y suplementado con inulina, y estos cultivos también se marcaron con NYST-F mediante espectroscopía de fluorescencia y microscopía. (Figuras 1d, e)20.

Después de demostrar la absorción de glicanos fluorescentes en aislados cultivados, marcamos metabólicamente bacterias de una muestra de heces de un voluntario humano sano. Se colocaron muestras de heces frescas en condiciones anaeróbicas dentro de los 30 minutos posteriores a la recolección y se congelaron alícuotas a -80 °C para analizarlas más a fondo con múltiples glicanos diferentes. En estas condiciones, se demostró que la mayoría de las bacterias siguen siendo viables46. Las bacterias se incubaron con CD-F durante 1 h en condiciones anaeróbicas. La medición de la fluorescencia de las células lavadas mostró una mayor fluorescencia después de la incubación con CD-F 4,4 μM durante 1 h (Fig. 1f). Es importante destacar que no observamos ningún aumento en la fluorescencia usando fluoresceína libre y cuando las bacterias recibieron un choque térmico antes de la incubación, lo que sugiere que el glicano fluorescente experimentó transporte activo. Concentraciones más altas de la sonda fluorescente o la prolongación del tiempo de incubación más allá de 1 h no dieron como resultado un aumento significativo de la fluorescencia (Fig. S1b, c). Luego repetimos estos experimentos utilizando citometría de flujo para cuantificar las poblaciones de células que absorbieron el glicano fluorescente. Se utilizaron bacterias sin marcar como control negativo para establecer el umbral de la población bacteriana fluorescente. El etiquetado de una muestra de microbiota intestinal con CD-F indicó que ca. El 1% de las células eran glicano+, mientras que no se detectó marcaje con fluoresceína libre o después de la inactivación por calor (Fig. 2a).

a Gráficos representativos de pseudocolor de citometría de flujo de etiquetado metabólico. Las bacterias aisladas de las heces se incubaron con CD-F 4,4 μM o fluoresceína con o sin inactivación por calor durante 1 h, se lavaron y analizaron mediante citometría de flujo. b Cuantificación de células glucano+ en muestras de heces incubadas con sonda CD-F 4,4 µM en presencia de concentraciones crecientes de β-ciclodextrina libre. Gráfico de barras que representa medias ± DE (n = 3). Significancia estadística comparada con la condición CD-F mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Especificidad del etiquetado CD-F (c), NYST-F (d) y GMP-F (e). Las bacterias aisladas de las muestras de heces se preincubaron en MM a 0 °C o en MM suplementado con glucosa al 0,1% a 37 °C durante 1 h y luego se marcaron con sondas CDF, NYST-F y GMP-F a 4,4 µM durante 1 h. a 37°C. Después del lavado, se midió el porcentaje de bacterias glicano+ mediante citometría de flujo. Los gráficos representan las medias ± DE (n = 3) del porcentaje de bacterias marcadas en diferentes condiciones. Significancia estadística comparada con la condición CD-F mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Los datos de origen y los detalles estadísticos se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para demostrar la especificidad del etiquetado de CD-F, realizamos un experimento de competencia con una concentración creciente de β-ciclodextrina (CD) sin marcar. El análisis de citometría de flujo reveló una reducción gradual en el etiquetado que fue significativa por encima de 436 μM de CD, correspondiente a un exceso de 100 veces sobre CD-F (Fig. 2b). Luego buscamos verificar si el marcaje se debía a la absorción de oligosacáridos o si el glicano fue hidrolizado por la superficie celular o por las glucósidos hidrolasas secretadas antes de la absorción. Por lo tanto, sintetizamos el equivalente de monosacárido (glucosa-F, 4) y disacárido (maltosa-F, 5) de la sonda CD-F (Fig. S2a). El análisis de citometría de flujo del etiquetado metabólico mostró muy poco o ningún etiquetado con maltosa-F y glucosa-F en comparación con CD-F, lo que confirma que solo se absorbieron oligosacáridos más grandes con etiquetas fluorescentes (Fig. S2b).

Además, confirmamos que el etiquetado observado fue en gran medida un proceso activo y dependiente de la energía al realizar el etiquetado a 0 ° C, lo que suprimió el etiquetado tanto para CD-F como para NYST-F (Fig. 2c, d). La utilización de polisacáridos complejos también suele estar reprimida por la presencia de monosacáridos simples, como la glucosa47. Por lo tanto, realizamos los experimentos de etiquetado en medios que contengan un mínimo de 0,1% de glucosa. Bajo estas condiciones de represión catabólica, la captación de nuestras sondas fue de hecho reprimida, lo que sugiere un vínculo entre la captación de la sonda y el metabolismo (Fig. 2c, d).

Alentados por estos resultados, sintetizamos un tercer oligosacárido fluorescente estructuralmente diferente funcionalizando aleatoriamente 63, 64-α-D-galactosil-β (1, 4) -D-manopentaosa para obtener GMP-F (3, Fig. 1c). Los galactomananos son glicanos de hemicelulosa que se encuentran en nuestra dieta (p. ej., granos de café y tomates), especialmente en forma de agentes espesantes, como la goma guar21. El etiquetado metabólico de las células bacterianas por GMP-F se confirmó mediante citometría de flujo y se contrastó con la falta de captación de la sonda a 0 °C y en condiciones de represión catabólica (Fig. 2e). En conjunto, estos resultados sugieren que los miembros de la microbiota intestinal absorben los oligosacáridos fluorescentes de una manera específica y dependiente de la energía, y en gran medida están relacionados con el metabolismo bacteriano.

Luego acoplamos el etiquetado metabólico y FACS con la secuenciación del amplicón de ADNr 16S para identificar las bacterias responsables de la absorción de glucanos. Utilizamos nuestros tres glicanos fluorescentes en muestras fecales de tres individuos sanos no relacionados de la misma manera. Las bacterias de alícuotas de heces se incubaron durante 1 h con una sonda fluorescente en medio mínimo, se lavaron y luego se procesaron para citometría de flujo. Se utilizaron muestras de control sin etiquetar para establecer el umbral de activación para la clasificación de células glucano+. Luego se lisaron las células clasificadas con Glycan+ antes de la extracción del ADN y la amplificación de la región V4 del gen bacteriano 16S rRNA. La secuenciación Illumina MiSeq se realizó en ADN extraído de entre 1 y 3 millones de células clasificadas y en ADN extraído de las tres muestras iniciales de heces para comparar. Las lecturas de secuencia se procesaron y anotaron utilizando el canal ANCHOR48. Brevemente, solo se seleccionaron, alinearon y eliminaron las secuencias de extremos emparejados en las que el conjunto de cebadores se detectó con precisión antes de la selección de variantes de secuencia exacta (ESV). La anotación consultó 4 repositorios de secuencias con estrictos criterios BLASTn (>99% de identidad y cobertura). Tenga en cuenta que todas las anotaciones se consideran putativas y están sujetas a mejoras a medida que se resuelven los errores de la base de datos y se caracterizan nuevas especies.

Obtuvimos un promedio de 68.122 recuentos de lectura por muestra, que oscilan entre 29.360 y 85.124. El proyecto ANCHOR identificó un total de 334 ESV distintas. De estos, 93 ESV podrían asignarse sin ambigüedades a una especie con 100% de cobertura y >99% de identidad, y se obtuvo 100% de identidad para 86 de los 93 ESV. Las muestras de glicano+ clasificadas exhibieron índices de diversidad α bacteriana más bajos (ESV observados, Chao1 y Shannon) que los de las muestras de heces iniciales, lo que es consistente con las células marcadas que representan un subconjunto de las muestras iniciales de microbiota intestinal (Fig. S3a). Un análisis de componentes principales (PCoA) mostró una agrupación de muestras según el individuo (Fig. S3b), lo que indica que las diferencias interpersonales en las comunidades microbianas explicaron la mayor parte de la varianza (45%). Sin embargo, el análisis de ordenación restringida (CAP) se realizó utilizando las células marcadas versus las muestras de heces iniciales como hipótesis a priori y produjo dos grupos distintos en un eje de ordenación; este resultado explicó el 9% de la varianza (Fig. S3c) y una vez más apoyó el enriquecimiento de taxones bacterianos específicos de la muestra de heces original. Se observó agrupación de células NYST-F+ de las otras dos sondas restringiendo aún más el análisis por tipo de glucano (Fig. S3d).

Se realizó un análisis de abundancia diferencial DESeq2 para identificar ESV que estaban sobrerrepresentados en las muestras CD-F+, GAL-F+ o NYST-F+ en comparación con las muestras de heces iniciales utilizando una tasa de descubrimiento falso (FDR) de 0,1 como umbral de significancia49. A pesar del bajo número de muestras, múltiples ESV aumentaron por encima de la significación y estuvieron claramente sobrerrepresentados en las muestras de glucano+ (Fig. 3a). La secuenciación metagenómica de escopeta de una de las muestras de heces iniciales se realizó por triplicado y se encontraron secuencias coincidentes para cada una de las ESV estadísticamente significativas, lo que confirma su identidad (Tabla complementaria 2). Además, dado que ANCHOR retuvo las secuencias 16S, los genomas de las especies bacterianas importantes podrían coincidir con una cobertura e identidad del 100 % para 7/8 de los ESV estadísticamente significativos; por lo tanto, podríamos analizar sus genomas más extensamente (Tabla complementaria 3).

un análisis de abundancia diferencial de DESeq2 que compara la abundancia de ESV en las heces iniciales versus las muestras de glicano+ expresadas como un gráfico de volcán del valor p ajustado en función del cambio log2 veces. La línea horizontal representa significación estadística y se dibuja con un FDR de 0,1. Los símbolos están coloreados según los filos y los ESV que están estadísticamente sobrerrepresentados en las muestras de glucano+ están etiquetados. b Distribución de los ESV de los filos principales en el eje de abundancia diferencial. La significación estadística comparó los Bacteroidetes y los Firmicutes mediante una prueba de Mann-Whitney de dos colas. c – f Gráficos de barras de abundancia diferencial de DESeq2 para el orden Bacteroidales (c), Prevotella copri (d), Blautia wexlerae_1 (e) y Collinsella aerofaciens (f). Los gráficos de barras representan el error estándar de cambio de log2 veces ± log2 de cambio determinado por DESeq2. Los datos de origen y los detalles estadísticos se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Los ESV que pertenecen al filo Bacteroidetes estuvieron sobrerrepresentados en muestras de glicano + en comparación con Firmicutes (Fig. 3b). Además, el orden Bacteroidales estuvo significativamente sobrerrepresentado en las muestras marcadas con glucano+ para todos los glucanos, lo que indica la capacidad general de sus miembros para metabolizar los glucanos (Fig. 3c)8.

En general, encontramos nueve ESV identificados a nivel de especie que estaban sobrerrepresentados en las muestras de glucano+ (Fig. 3a). De estos, cuatro se conocían basándose en la capacidad metabólica previa. Se encontró que Prevotella copri (Bacteroidetes) estaba sobrerrepresentada en las tres muestras de glicano+ (Fig. 3d), lo que respalda su extenso repertorio de genes de utilización de polisacáridos y su conocida capacidad para crecer en almidón, inulina y galactomanano50,51. Además, observamos que Parabacteroides distasonis estaba marcado con ciclodextrina (Fig. 3a). Nuestra secuencia 16S coincidió con 100% de homología y cobertura para la cepa P. distasonis CL03T12C09, que contiene 6 glucósidos hidrolasas de la familia 13 (GH13, α-amilasa) en su repertorio CAZyme que son consistentes con el metabolismo de los almidones.

Los siguientes ESV estuvieron sobrerrepresentados en las muestras NYST+ y no eran consumidores conocidos de FOS: Blautia wexlerae (Firmicutes) y Collinsella aerofaciens (Actinobacteria) (Fig. 3a, e, f). Además, los siguientes Bacteroidales que estaban sobrerrepresentados en las muestras de GMP+ no eran consumidores conocidos de galactomanano: Alistipes communis, Bacteroides vulgatus y Bacteroides caccae (Fig. 3a). Por lo tanto, examinamos estas interacciones con más detalle para determinar si estos glicanos conducen al crecimiento de estos aislados in vitro.

Se demostró que B. wexlerae aumenta en un estudio de suplementación con FOS en cerdos52 y en la fermentación ex vivo de la microbiota humana53, pero se sabe poco sobre su metabolismo de glucanos y esta especie no está presente en la base de datos CAZy24. Como la base genética del metabolismo de FOS en L. acidophilus implica un transportador MsmEFGK ABC y un GH3254, buscamos este PUL homólogo en la cepa BIOML-A12 de B. wexlerae, que coincidía con nuestra secuencia con un 100% de identidad y cobertura. Encontramos un sistema similar en B. wexlerae que contenía genes transportadores GH32 y MsmEFG, lo que respaldaba la absorción y el metabolismo de FOS (Figs. 4e, S4a). Luego obtuvimos B. wexlerae (DSM 19850, 100% de identidad y cobertura de nuestro ESV) y evaluamos su capacidad para crecer con varios carbohidratos. Si bien la cepa exhibió un crecimiento mínimo en medios mínimos sin carbohidratos, mostró un crecimiento robusto cuando se complementó con fructosa, FOS o inulina en el medio (Fig. 4a). Además, sólo se observó un crecimiento lento con levan, un β-2,6-fructooligosacárido relacionado. Además, NYST-F marcó firmemente B. wexlerae en cultivo (Fig. 4b). Por lo tanto, B. wexlerae es un consumidor de FOS y contiene supuestos genes compatibles con el metabolismo de FOS para el crecimiento.

Crecimiento de B. wexlerae (a) y C. aerofaciens (c) en MM suplementado con diferentes fructooligosacáridos durante 48 h. La viabilidad de las bacterias se evaluó mediante el crecimiento en MM suplementado con fructosa. Todas las mediciones de crecimiento son por triplicado. Se incubaron cultivos exponenciales de B. wexlerae (n = 5) (b) y C. aerofaciens (n ​​= 3) (d) en MM suplementado con FOS durante 1 h con NYST-F. El porcentaje de bacterias NYST+ se midió mediante citometría de flujo. Los datos de tres a cinco experimentos independientes se muestran como medias ± DE. Significancia estadística comparada con la condición GMP-F mediante ANOVA unidireccional con prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Mapa de posibles genes asociados al metabolismo de FOS. Identificación de supuestos genes implicados en el metabolismo de FOS en B. wexlerae (e) y C. aerofaciens (f). Las alineaciones BLAST se realizaron en el genoma completo disponible en la base de datos del NCBI con las glucósidos hidrolasas conocidas que participan en el metabolismo de GMP y FOS. Los datos de origen y los detalles estadísticos se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego examinamos C. aerofaciens, que se informó que exhibía un fenotipo de crecimiento débil en levan pero no en FOS55. En la base de datos CAZy, tres GH32 están anotados en el genoma de C. aerofaciens ATCC 25986 (100% de identidad y cobertura para nuestro ESV). El primer PUL comprende dos genes GH32 que flanquean un gen IIC de la subunidad fosfoenolpiruvato:sistema de azúcar fosfotransferasa (PTS). El segundo locus contiene un gen GH32 y una subunidad IIB de PTS. Estos dos loci son homólogos a los PUL conocidos involucrados en el metabolismo de FOS en Anaerostipes hadrus, estrechamente relacionado, lo que sugiere que están involucrados en el metabolismo del polímero de fructosa (Figs. 4f, S4b)56. Obtuvimos C. aerofaciens ATCC 25986 y confirmamos que podría crecer lentamente en medios mínimos que contengan levadura y extracto de carne suplementados con levano, pero no con FOS o inulina (Fig. 4c). Sin embargo, los cultivos aislados de C. aerofaciens fueron marcados por NYST-F (Fig. 4d). Este resultado muestra que, si bien C. aerofaciens consume oligofructosa, es específica para los enlaces β-2,6 que se encuentran en el levano, a diferencia del enlace β-2,1 en FOS y la inulina.

B. vulgatus y B. caccae también fueron marcadas significativamente por GMP-F (Fig. 3a) a pesar de la falta de GH26 en los genomas de aislados secuenciados en la base de datos CAZy24. Además, se sabe que B. caccae no crece en este sustrato55. Así, cultivamos B. vulgatus (ATCC 8482) y B. caccae CLD22004 (que se aisló de una de las muestras fecales, vide infra) y confirmamos la falta de crecimiento en medios mínimos (MM) con 0,1% de GMP como única fuente de carbono. , mientras que se observó crecimiento en MM suplementado con glucosa (Fig. S5). Además, confirmamos que ambas cepas fueron marcadas por GMP-F después del crecimiento en BHI, como se vio por citometría de flujo (2,18% y 1,25% de células glucano+ para B. vulgatus y B. caccae, respectivamente), que fue anulada por choque térmico ( Figura S5). Estos datos sugieren que se produjo cierta absorción de glucano fluorescente, pero probablemente mediante un PUL con un sustrato relacionado, o que el metabolismo no fue suficiente para sostener el crecimiento de estos aislados.

De manera similar, Alistipes communis (también conocido como Alistipes obesi)57 fue marcado con galactomanopentaosa (Fig. 3a). Se sabe poco sobre el metabolismo del galactomanano en A. communis, pero se sabe que esta bacteria exhibe actividad α-galactosidasa58. La cepa A. communis 5CBH24 (100 % de identidad y cobertura con respecto a nuestro ESV) codifica un PUL clásico similar a SusC/D con 2 GH26 (con actividad β1-4-mananasa), un GH130 (una manosilfosforilasa) y un GH97. (actividad α-galactosidasa), que es consistente con el metabolismo del galactomanano (Fig. S5j) y se asemeja al conocido PUL de galactomanano en B. ovatus18. Sin embargo, si bien A. communis 5CBH24 podría crecer lentamente en medios Columbia empobrecidos en carbohidratos, su crecimiento aumentó al complementar con glucosa pero no con galactomanano (Fig. S5g), lo que sugiere que esta cepa es incapaz de utilizar este sustrato para el crecimiento.

En conjunto, estos resultados demuestran que el 66 % (6/9) de los ESV significativamente sobreexpresados ​​en las muestras de glicano+ eran consumidores conocidos o confirmados del glicano, pero que el 33 % (3/9) no pudo usar los glucanos para el crecimiento in vitro. .

Teniendo en cuenta que los consumidores de glucano se enriquecieron en las células marcadas clasificadas, utilizamos además este subconjunto de células para aislar consumidores de glucano específicos de muestras fecales humanas. Esto nos dio acceso a las cepas bacterianas presentes en la muestra y nos permitió estudiar su fenotipo de crecimiento directamente. Primero, las bacterias fecales se marcaron con GMP-F durante 1 h y las células glicano+ se clasificaron durante 5 minutos (alcanzando aproximadamente 27k células clasificadas) antes de resuspenderse inmediatamente en PBS reducido en condiciones anaeróbicas. Luego se cultivaron bacterias diluidas en BHI durante 72 h. Se aisló un consumidor de GMP (cepa CLD22001) de este cultivo, como lo demuestra su capacidad para crecer en MM con 0,1% de GMP como única fuente de carbono, pero no con MM solo (Fig. 5a). Luego realizamos la extracción de ADN y la amplificación de toda la región de ADNr 16-S seguida de la secuenciación de Sanger. Al realizar la alineación BLAST de la secuencia V1V9 con la colección de la base de datos de nucleótidos del NCBI, la cepa CLD22001 se identificó como Bacteroides xylanisolvens con 99,79 % de identidad y 100 % de cobertura con B. xylanisolvens (cepa funn3). Múltiples miembros de B. xylanisolvens albergan el PUL de galactomanano que se caracterizó en B. ovatus, lo que les permite crecer en galactomanano18,19. Mediante citometría de flujo, confirmamos que las células B. xylanisolvens CLD22001 fueron marcadas por GMP-F cuando se cultivaron en MM que contenía GMP (Fig. 5a). De la misma manera, aislamos la cepa CLD22004 de B. caccae, que tiene 100% de cobertura y 98,95% de identidad con la cepa CL03T12C61. Demostramos que esta cepa estaba marcada con GMP-F pero no podía crecer en GMP (Fig. S5a-c).

a Crecimiento de B. xylanisolvens CLD22001 en medio mínimo suplementado o no con galactomanopentaosa al 0,1%. Las curvas de crecimiento son la media y el error estándar de tres réplicas independientes. Captación de GMP-F por B. xylanisolvens CLD22001. Los cultivos exponenciales de B. xylanisolvens CLD22001 en MM suplementados con GMP se incubaron durante 1 h con GMP-F. El porcentaje de bacterias GMP+ se midió mediante citometría de flujo. Los datos de tres experimentos independientes se muestran como medias ± DE. Significancia estadística comparada con la condición GMP-F mediante ANOVA unidireccional con prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Crecimiento de B. uniformis CLD22005 (b), B. angulatum CLD22003 (c) y E. coli CLD22006 (d) en MM suplementado o no con 0,1% de FOS. Cuantificación de la absorción de NYST-F por B. uniformis CLD22005 (b), B. angulatum CLD22003 (c) y E. coli CLD22006 (d) mediante citometría de flujo, con o sin choque térmico antes del etiquetado. Todas las mediciones se realizaron por triplicado y se muestra la media ± DE. Significancia estadística comparada con la condición de la sonda mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni. Los datos de origen y los detalles estadísticos se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Luego cultivamos células clasificadas NYST-F+ para aislar a los consumidores de FOS. Aquí, las bacterias marcadas clasificadas se resuspendieron inmediatamente en medio ABB reducido suplementado con 0,1% de FOS en condiciones anaeróbicas. Después de 48 h de incubación, las bacterias cultivadas se transfirieron en una dilución de 1/100 a MM suplementado con 0,1% de FOS como única fuente de carbono y se incubaron durante 48 h en condiciones anaeróbicas. Luego se aislaron los consumidores de FOS en ABB o TSA suplementados con sangre de oveja al 5% durante 72 h y luego se caracterizaron como se describió anteriormente. Aislamos un Bacteroides uniformis (cepa CLD22005, con 100% de cobertura e identidad con la cepa CL11T00C07) que podría crecer en MM que contiene FOS pero no en MM solo (Fig. 5b). El etiquetado de los aislados cultivados fue bajo pero fue abolido por el choque térmico (Fig. 5b). B. uniformis (CL11T00C07) contiene un PUL 32 previsto que contiene 4 GH32; un GH172; y una familia de módulos de unión a carbohidratos 38 (CBM38), que es conocida por su unión a inulina, junto con el transportador SusCD, y estos resultados son consistentes con el consumo de FOS. En consecuencia, se sabe que B. uniformis crece con fructosa e inulina59. Además, la cepa CLD22003 que creció en MM suplementado con FOS se identificó como Bifidobacterium angulatum (Actinobacteria) con una cobertura del 100 % y una identidad del 99,79 % con múltiples cepas, incluida DMS 20098. El metabolismo de FOS de B. angulatum se confirmó mediante el crecimiento en MM suplementado con FOS como única fuente de carbohidratos y una fuerte absorción de la sonda NYST-F, medida por citometría (Fig. 5c). El género Bifidobacterium es bien conocido por el metabolismo de los FOS en estudios que involucran dietas enriquecidas con suplementos de FOS, y B. angulatum es un consumidor conocido in vitro60,61. Finalmente, obtuvimos algunas Proteobacterias, incluida la cepa CLD22006 con un gen 16-S que coincide con varias cepas de Escherichia coli con 100% de cobertura e identidad, incluidas las cepas TUM13867. La cepa de E. coli podría crecer en MM que contenía FOS, y el etiquetado NYST-F fue sólido (Fig. 5d). Se ha informado que las enterobacterias, como E. coli, metabolizan FOS62.

Estos resultados demuestran que la clasificación y el cultivo funcionales pueden conducir al aislamiento e identificación de consumidores de glucanos a partir de muestras de heces. Si bien aquí investigamos en detalle tres estructuras diferentes de glucanos, el método es aplicable a otras estructuras. De hecho, ampliamos nuestro repertorio de glicanos preparando 5 oligosacáridos conjugados con fluoresceína adicionales basados ​​en xilano, manano, arabinoxilano, arabinano y FOS (Fig. S6a) y confirmamos mediante citometría de flujo que estos glicanos adicionales fueron absorbidos por bacterias en una muestra fecal. (Figura S6b).

A medida que avanzamos más allá de una comprensión descriptiva de la microbiota intestinal humana, se necesitan ensayos funcionales para examinar el papel de bacterias específicas dentro de la comunidad y en relación con el huésped25. Los glicanos complejos derivados de la dieta son un importante impulsor de la diversidad y el metabolismo de los microbios intestinales, pero todavía tenemos una comprensión incompleta del metabolismo específico de los glicanos en el intestino. Sin embargo, este conocimiento es crucial para comprender los mecanismos de las aplicaciones prebióticas, en las que los glicanos accesibles a la microbiota se utilizan para manipular la composición y el metabolismo microbiano intestinal63,64,65,66. Identificar las bacterias intestinales que consumen glicanos prebióticos es un paso importante para, en última instancia, revelar factores bacterianos o metabolitos que median los beneficios para la salud del huésped67.

Aquí, utilizamos un ensayo funcional que combinó el etiquetado metabólico activo con FACSeq o culturómica para arrojar luz sobre la absorción de glucanos en muestras de microbiota intestinal humana, sin conocimiento previo de los genes metabólicos involucrados. El etiquetado metabólico de las bacterias mediante glicanos fluorescentes es posible porque las bacterias absorben los oligosacáridos, lo que permite que una pequeña etiqueta fluorescente pase desapercibida15,40. De hecho, el SUS prototípico hidroliza los polisacáridos de la superficie celular en oligosacáridos que se absorben dentro de la célula para su posterior metabolismo. Esta absorción evita que otras bacterias se beneficien de los subproductos metabólicos. Nuestros experimentos mostraron que la sonda de monosacáridos de glucosa no era captada, a diferencia de los oligosacáridos más grandes, que sí se transportaban a las células bacterianas. Esto sugiere que la etiqueta de fluoresceína interfiere con el transporte de monosacáridos pequeños pero no con oligosacáridos más grandes. Sin embargo, también es posible que se produzca una apertura del anillo o una hidrólisis parcial de la ciclodextrina antes de la absorción intracelular. Minimizamos los posibles efectos perjudiciales de la conjugación de colorantes mediante la funcionalización aleatoria en diferentes posiciones, aumentando así las posibilidades de que el fluoróforo no enmascarara el motivo de reconocimiento de glicano del dominio o transportador de unión a carbohidratos. En contraste con la utilización egoísta de polisacáridos, algunas bacterias intestinales hidrolizan polisacáridos en la superficie celular, liberando monosacáridos que otras especies utilizan fácilmente68. Nuestro enfoque solo detecta la absorción de oligosacáridos y no identifica la alimentación cruzada bacteriana ni el metabolismo secundario posterior, que aún no se han determinado. Además, es posible que un oligosacárido sea parcialmente hidrolizado por una bacteria y absorbido por otra68,69.

Este estudio de prueba de principio se realizó utilizando tres glicanos diferentes en muestras de tres voluntarios sanos no relacionados. El análisis de abundancia diferencial destacó la capacidad de absorción de varias bacterias, y ya se sabía que algunas de estas bacterias consumían almidón, galactomanano y FOS. Nuestro trabajo destacó claramente la capacidad generalista del orden Bacteroidales, en línea con su gran repertorio CAZyme conocido, mientras que la absorción de glucanos en Firmicutes se distribuyó de manera más dispersa y se limitó a solo uno de los glucanos probados, nuevamente en concordancia con el hecho de que tienen un repertorio más pequeño de CAZymes que Bacteroidetes8.

Es importante destacar que este canal nos permitió identificar a Firmicutes B. wexlerae como consumidor de FOS e inulina. Es probable que este metabolismo esté mediado por un PUL que contiene un GH32 y un transportador ABC con homología con el FOS PUL de L. acidophilus (Fig. S4b). Ampliar el análisis a diferentes glicanos y diferentes muestras probablemente generará otros consumidores previamente desconocidos. Ya hemos demostrado la síntesis de 5 sondas adicionales y hemos demostrado su etiquetado de bacterias intestinales en una muestra fecal (Fig. S6), destacando la viabilidad de nuestro enfoque.

El etiquetado observado aquí fue anulado en gran medida a 0 °C o en presencia de glucosa, lo que sugiere un proceso activo relacionado con el metabolismo. Sin embargo, tres bacterias (A. communis, B. vulgatus y B. caccae) marcadas con GMP-F carecían de la capacidad de crecer en galactomanano in vitro. Si bien en este caso el GMP-F puede unirse a proteínas de superficie sin absorción, la pérdida de señal fluorescente tras la inactivación por temperatura respalda la absorción activa de glicanos. Es posible que el glicano se active y esté unido o absorbido por un PUL activo en un glicano estructuralmente relacionado y que la especificidad de la GH impida un metabolismo eficiente. De hecho, C. aerofaciens fue marcado por nistosa que contenía enlaces de β-2,1 fructosa, pero no pudo crecer en este sustrato y, en cambio, metabolizó el levano que contenía enlaces de β-2,6-fructosa para crecer. Además, A. communis alberga un PUL con un gran parecido con el conocido PUL de galactomanano de B. ovatus, lo que sugiere actividad sobre un sustrato que contiene α-galactosa y β-manosa, incluso si no se observó crecimiento en galactomanano18. Se ha observado la ausencia de crecimiento en cepas bacterianas que codifican el PUL apropiado en su genoma para arabinogalactano en P. copri y puede deberse a ligeras diferencias en el sustrato o a una especificidad inexacta basada en la anotación genética50. Alternativamente, los glicanos pueden ser reconocidos por proteínas implicadas en vías de detección de quórum o en vías de detección del huésped, como se ha sugerido para la fucosa en patógenos70,71. Por lo tanto, el etiquetado metabólico por sí solo, incluso con genes consistentes con una actividad, no es suficiente para inferir el metabolismo para el crecimiento, y se necesitan más estudios para caracterizar completamente las posibles vías metabólicas involucradas y su función para la célula bacteriana.

Por lo tanto, ampliamos nuestro enfoque para incluir cultivos bacterianos después de la clasificación de las células glicano+ para aislar a los consumidores en la muestra fecal estudiada. Esto nos permitió validar directamente el crecimiento in vitro utilizando las cepas bacterianas presentes en las muestras y evitar el problema de inferir una cepa basada en una porción del gen 16S rRNA. En un estudio de prueba de principio, aislamos 4 clones de 3 filos diferentes que podrían consumir GMP y FOS como única fuente de carbono en cultivo. Los clones se identificaron mediante secuenciación de Sanger del gen 16S rRNA como B. xylanisolvens (Bacteroidetes) que crece en GMP y B. angulatum (Actinobacteria), B. uniformis (Bacteroidetes) y E. coli (Proteobacteria) que crecen en FOS. Si bien estos consumidores eran conocidos, una culturómica más extensa con medios de crecimiento diferentes y más específicos podría generar consumidores desconocidos72. Además, el ambiente aeróbico del paso de clasificación probablemente sea perjudicial para muchos anaerobios estrictos, y la clasificación en condiciones anóxicas probablemente mejorará la recuperación de bacterias vivas marcadas con glicanos fluorescentes.

Los enfoques existentes para estudiar el metabolismo de los glicanos bacterianos generalmente se han centrado en comunidades complejas simplificadas, que pueden ser difíciles de reproducir a pesar de proporcionar información incomparable32,33. Nuestro enfoque complementa dichos estudios mediante el uso de muestras fecales humanas completas, que también podrían derivarse del paciente para capturar diferentes taxones bacterianos. Como nuestra tubería es funcional e incluye un paso de clasificación de células, las células muertas o dañadas en las muestras originales no están etiquetadas incluso si codifican la maquinaria metabólica adecuada. Por tanto, nuestro método es complementario a los métodos genómicos que no discriminan entre células activas, inactivas, vivas o dañadas34. Ampliar este enfoque a otros glicanos y muestras puede ayudar a anotar aún más la especificidad de PUL y descubrir genes y vías metabólicas.

Debido a su naturaleza no intrusiva, el muestreo de heces humanas es un poderoso sustituto de la microbiota intestinal, ya que las bacterias pueden permanecer metabólicamente activas cuando se las coloca rápidamente en condiciones anóxicas35,73,74. Sin embargo, se debe reconocer que las muestras de heces no proporcionan información sobre la ubicación de bacterias intestinales específicas a lo largo del tracto digestivo o a lo largo de la profundidad de la capa mucosa y que su composición representa bacterias eliminadas75. Además, las muestras de heces varían en composición según la consistencia de las heces, lo que refleja diferencias en el tiempo de tránsito y un muestreo de nicho potencialmente diferente76. Sin embargo, este proceso debería ser aplicable a otros tipos de microbiota intestinal, como las biopsias por colonoscopia.

Aquí, describimos el uso de una tubería funcional que identifica bacterias que absorben glicanos específicos en muestras complejas de microbiota intestinal, ampliando así nuestra comprensión funcional del metabolismo de los glicanos en la microbiota intestinal humana. La aplicación de esta tubería a otras estructuras de glucanos y a otras poblaciones humanas con dietas distintas, así como a individuos con enfermedades gastrointestinales, podría ayudar a identificar supuestos consumidores de glucanos dietéticos y estructuras prebióticas. Además, la combinación de este método con la culturómica es útil para aislar consumidores bacterianos sin conocer los genes específicos implicados, lo que podría conducir al descubrimiento de nuevas CAZimas. El método también podría combinarse con otros análisis genómicos, como la metagenómica y la genómica unicelular, para caracterizar el metabolismo de los glucanos en bacterias no Bacteroidetes y discriminar entre el metabolismo para el crecimiento y el metabolismo sin crecimiento.

Lactobacillus acidophilus (Moro) Hansen y Mocquot (ATCC® 4356™) (La) y Klebsiella oxytoca M5A1 (Ko), que se adquirieron en la American Type Culture Collection (Rockville, MD), se cultivaron a 37 °C en De Man, Medio Rogosa, medio Sharpe (MRS) y medio Luria-Bertani (LB), respectivamente.

La síntesis detallada de los glicanos conjugados con fluoresceína se proporciona en la información de respaldo, junto con los cromatogramas de HPLC.

El protocolo A04-M27-15B fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de McGill. Hemos recibido el consentimiento informado por escrito de los participantes para el uso de muestras humanas. Fueron elegibles los participantes sanos con un índice de masa corporal entre 18,5 y 30, sin enfermedad gastrointestinal diagnosticada, sin tratamiento terapéutico en curso y sin uso de antibióticos 3 meses antes del inicio del estudio. La información del sujeto se registró en el momento del muestreo. La edad de los donantes osciló entre 21 y 40 años. Los experimentos iniciales se realizaron con una muestra de un donante masculino. El proceso de etiquetado metabólico-FACSeq se realizó en muestras de 1 mujer y 2 hombres de entre 30 y 40 años, y el IMC osciló entre 19 y 27 kg/m2. Se recogieron muestras fecales frescas y se colocaron inmediatamente en una cámara anaeróbica, se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Los cultivos en medio mínimo M9 (MM M9) de Ko suplementado con β-ciclodextrina al 0,1% se recogieron durante la fase de crecimiento exponencial mediante centrifugación, se lavaron en MM M9 y se suspendieron en 195 µl de MM M9. Ko se trataron con sondas CD-F 500 nM o un volumen igual de células MM M9 como control. Las células se incubaron con agitación durante 30 min a 37 °C en la oscuridad. Las células se recogieron mediante centrifugación a 15.000 x g durante 5 minutos y se lavaron 2 veces con 1 ml de MM M9. Los sedimentos se resuspendieron en 200 µl de MM M9 y la fluorescencia se midió utilizando un lector de placas Spark 10 M Tecan a una longitud de onda de excitación de 485 nm después de la emisión a 535 nm. Las mediciones de fluorescencia se realizaron por triplicado y los valores medios y las desviaciones estándar se muestran en las figuras.

Cultivos en MRS personalizado (cMRS) (peptona (10 g/L), extracto de levadura (5 g/L), acetato de sodio (5 g/L), citrato de amonio (92 g/L), fosfato de potasio (2 g/L). ), sulfato de magnesio (0,2 g/l), sulfato de manganeso (0,05 g/l), Tween 80 (1 ml\l)) de La suplementado con 0,1 % de inulina se recogieron durante el crecimiento en fase exponencial mediante centrifugación, se lavaron en cMRS y se suspendieron. en 195 µL de cMRS. La se trataron con 500 nM de sondas NYST-F o un volumen igual de cMRS como control. Las células se incubaron con agitación durante 30 min a 37 °C en la oscuridad. Las células se recogieron mediante centrifugación a 15.000 x g durante 5 minutos y se lavaron 2 veces con 1 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Los sedimentos se resuspendieron en 200 µl de PBS y se midió la fluorescencia utilizando un lector de placas Spark 10 M Tecan a una longitud de onda de excitación de 485 nm después de la emisión a 535 nm. Las mediciones de fluorescencia se realizaron por triplicado y los valores medios y las desviaciones estándar se muestran en las figuras.

Después del etiquetado de carbohidratos, se fijaron Ko o La durante 30 minutos con una solución de paraformaldehído al 4%, se lavaron con una solución de PBS y se mezclaron en volúmenes iguales con el reactivo antifade ProLong Gold (Invitrogen). Las bacterias fijadas se montaron en un portaobjetos y un cubreobjetos, y las imágenes se adquirieron con un microscopio confocal LEICA SP8 (para Ko) y un microscopio Leica DM100 (para La) y se procesaron con el software Leica LAS X.

El análisis de citometría de flujo se realizó en un analizador de 20 parámetros LSR Fortessa de 5 láseres. La clasificación de células se realizó con 3 láseres, 13 detectores FACSAria-III o 4 láseres y 18 detectores FACSAria Fusion. Los datos se analizaron utilizando el software BD FACSDiva o FlowJo. Para establecer los umbrales para detectar específicamente las células marcadas por las sondas fluorescentes, utilizamos células no marcadas como controles negativos. El umbral de detección de señales en el canal FITC se estableció en 103 en comparación con la señal máxima generada por el control negativo en 3 × 102. El umbral de activación se puede ajustar en diferentes niveles para ajustar la sensibilidad del ensayo dependiendo de las sondas. Se analizaron cincuenta mil o 100.000 eventos por muestra y se midió la fluorescencia de FITC utilizando el canal FITC con excitación a 488 nm y emisión a 535 nm. Se realizó la activación de FSC y SSC (dispersión directa y lateral, respectivamente) para excluir dobletes. Se clasificaron un total de 1 a 3 × 106 células para cada muestra.

Todos los experimentos de etiquetado se realizaron en condiciones anaeróbicas (87% N2, 10% CO2 y 3% H2). Se pesó una muestra fecal de 0,1 g y se diluyó a 1:10 g/mL en medio mínimo (MM) (KH2PO4 6,6 mM (pH 7,2), NaCl 15 mM, MgCl2 100 μM, CaCl2 175 μM, MnSO4 50 μM, 5 mM ( NH4)2SO4, FeSO4 15 µM, NaHCO3 24 µM, L-cisteína 1 g/L-1, hematina 1,9 µM, hemina 6 µM y vitamina B12 200 ng/ml-1), se agitó minuciosamente y se centrifugó durante 3 minutos a 700 × g. Se guardó el sobrenadante y se descartó el sedimento. El sobrenadante se centrifugó durante 5 minutos a 6500 x g, se desechó el sobrenadante y el sedimento se lavó con MM. El sedimento se resuspendió en 200 µl de MM. Se añadieron sondas de carbohidratos a una concentración final de 4,4 µM. La incubación se realizó a 37 °C durante una hora protegida de la luz. Luego, las células se centrifugaron durante 5 minutos a 6500 x g, se descartó el sobrenadante y el sedimento se lavó dos veces con PBS reducido (rPBS). El sedimento final se resuspendió en 500 µl de rPBS y se mantuvo a 4 °C protegido de la luz. Luego, la suspensión bacteriana se diluyó en rPBS para el análisis de citometría de flujo.

El marcaje metabólico se realizó como anteriormente pero con la adición de β-ciclodextrina sin marcar (218 µM, 436 µM, 872 µM y 1,74 mM) con la sonda CD-F. El nivel de fluorescencia se midió mediante citometría de flujo.

El pretratamiento térmico se realizó después de la preparación del sedimento bacteriano a partir de la muestra fecal como se describió anteriormente. La incubación fue durante 10 minutos a 65 °C seguida de enfriamiento a 37 °C antes de realizar el marcaje metabólico como se describe anteriormente.

Se realizó una incubación en MM suplementado con glucosa al 0,1% durante una hora antes del marcaje metabólico como se describe anteriormente.

El ADN se extrajo de todas las muestras utilizando el kit AllPrep PowerFecal DNA/RNA (Qiagen, Canadá) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ADN se cuantificaron mediante el método de cuantificación fluorométrica Qubit (Invitrogen). La región V4 (basada en Escherichia coli) del ARN ribosómico (ARNr) 16S se apuntó para su amplificación mediante PCR utilizando el cebador directo 515F GTGCCAGCMGCCGCGGTAA y el cebador inverso 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT. Las etiquetas CS1 (ACACTGACGACATGGTTTCTACA) y CS2 (TACGGTAGCAAGACTTGGTCT) se utilizaron para agregar un código de barras y adaptadores de Illumina. La amplificación se realizó utilizando ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (New England BioLabs) con ciclos de PCR de la siguiente manera: paso de desnaturalización inicial de 98 °C durante 30 s, antes de 23 ciclos de 98 °C durante 10 s, 58 °C durante 15 s y 72 °C por 30 s, con una extensión final a 72 °C por 2 min. La plataforma MiSeq se utilizó para la secuenciación de extremos emparejados de 2 × 250 pb de los productos de PCR resultantes.

El análisis de los datos de secuenciación se realizó utilizando el sistema ANCHOR48. Brevemente, los amplicones potenciales se ensamblaron a partir de lecturas de alta calidad. Se conservaron contigs ensamblados de todas las longitudes para controlar la longitud inesperada del amplicón. Se evaluaron secuencias desreplicadas y las secuencias con un recuento superior a 9 se utilizaron como base segura para el análisis (umbral de anclaje). Estos se procesaron y anotaron en cuatro repositorios de secuencias principales (base de datos bacteriana NCBI seleccionada y Archaea RefSeq, NCBI nr/nt, SILVA, Ribosomal Database Project) con umbrales de identidad y cobertura >99 %. La diversidad y ordenación α y β se analizaron utilizando scripts R con la biblioteca vegana, y el análisis de abundancia diferencial se realizó utilizando DESeq249.

Los datos de metagenómica de escopeta para tres muestras (MX73_1, MX73_2 y MX73_3) se preprocesaron utilizando MicrobiomeAnalystR, un paquete R para procesamiento de datos de extremo a extremo, análisis estadístico y visualización de datos de secuenciación de microbiomas (https://github.com/xia -lab/MicrobiomeAnalystR)77. El proceso de preprocesamiento metagenómico MicrobiomeAnalystR integra fastp78, BBMap (https://escholarship.org/uc/item/1h3515gn) y Kaiju79 para realizar controles de calidad, descontaminación de la secuencia del huésped y perfiles taxonómicos, respectivamente. En primer lugar, se utilizó fastp para control de calidad, recorte de adaptadores y filtrado de calidad. En segundo lugar, las lecturas humanas se eliminaron utilizando BBMap mapeando las lecturas filtradas con el genoma de referencia hg38.fa. Finalmente, la clasificación taxonómica de las lecturas restantes de la base de datos NCBI RefSeq se realizó utilizando Kaiju.

Mapeo de secuencias de ARNr 16S a lecturas metagenómicas. Se utilizó BBduk (https://jgi.doe.gov/data-and-tools/bbtools/bb-tools-user-guide/bbduk-guide/) para mapear lecturas metagenómicas (longitud de 100 pb) a secuencias de ARNr 16S ( longitud de ~ 290 pb) de las 9 especies microbianas más importantes (como se muestra en la Fig. 3). El mapeo se realizó en las lecturas directa e inversa para cada muestra de forma independiente. Se estableció una hdist de 0 y no se permitieron discrepancias.

Los aislados se cultivaron anaeróbicamente (atmósfera: 87% N2, 10% CO2, 3% H2) a 37 °C durante la noche en medio de infusión cerebro-corazón (BHI). Los cultivos de la noche a la mañana se diluyeron luego a 1/250 en rPBS y se inocularon 10 µl de bacterias diluidas en 240 µl de medio mínimo suplementado con 0,1% del carbohidrato apropiado. El crecimiento se evaluó en una placa de 96 pocillos. La DO600 se midió en un lector de placas (EPOCH, Biotech) en condiciones anaeróbicas y se registró cada 5 min durante 72 h.

C. aerofaciens, B. wexlerae y A. communis requirieron condiciones y medio modificados para medir el consumo de carbohidratos. B. wexlerae se cultivó durante la noche en medio tripticasa de soja (TS) y se generaron curvas de crecimiento como se describe anteriormente. C. aerofaciens se cultivó durante la noche en medio Gam y el crecimiento se probó en MM suplementado con extracto de levadura (20 mg/ml), extracto de carne (10 mg/ml) y 0,1 % del carbohidrato apropiado. A. communis se cultivó durante 72 h en medio Columbia suplementado con hematina 1,9 µM, hemina 6 µM, FeSO4 15 µM y vitamina B12, K1 y K3 200 ng/ml-1. Para medir el crecimiento de A. communis durante 96 h, utilizamos los medios Columbia descritos anteriormente pero agotamos el almidón y la glucosa. A partir de entonces, se utilizó medio Columbia sin azúcar con el carbohidrato apropiado al 0,1% para medir el metabolismo del azúcar.

El control negativo consistió en 250 µL de MM suplementado con 0,1% de carbohidratos. Se realizaron tres réplicas para cada condición (N = 3) y las curvas de crecimiento se generaron en GraphPad Prism 9.

El ADN se extrajo de 1 ml de cultivo bacteriano durante la noche. Se utilizó el kit One-4-All Genomic DNA Miniprep (Biobasic) para extraer el ADN de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El gen 16S rDNA se amplificó mediante PCR y Génome Québec realizó la secuenciación de Sanger.

El ADN bacteriano total de las heces se extrajo utilizando el kit AllPrep PowerFecal DNA/RNA (Qiagen, Canadá) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los ADN se cuantificaron mediante el método de cuantificación fluorométrica Qubit (Invitrogen). Se envió ADN a Génome Québec para la secuenciación Illumina HiSeq 4000 PE de 100 pb para metagenómica de escopeta.

Las bacterias de las heces se marcaron durante una hora mediante sondas GMP-F o NYST-F como se describió anteriormente. Las bacterias marcadas con GMP-F o NYST-F se clasificaron en un FACSAria Fusion de 18 detectores de 4 láseres durante 5 minutos. Las bacterias fluorescentes seleccionadas se transfirieron inmediatamente a una cámara anaeróbica. Se cultivaron bacterias marcadas con GMP-F en placas de agar sangre BHI y TSA durante 72 h a 37 °C. Después de la incubación, se aislaron clones individuales en placas de sangre BHI o TSA y se desafiaron su capacidad de crecimiento en MM suplementado con GMP al 0,1%. Los clones consumidores de GMP se identificaron mediante la secuenciación del ARNr 16S con los cebadores 27F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG y 1492R GGTTACCTTGTTACGACTT.

Después de la clasificación, las bacterias marcadas con NYST-F se suspendieron en 5 ml de medio ABB suplementado con 0,1 % de FOS (ABB-FOS) y se incubaron durante 24 h a 37 °C. Después de la incubación, se transfirieron alícuotas de 100 µl de cultivo ABB-FOS a 5 ml de MM suplementado con 0,1 % de FOS (MM-FOS) y se incubaron durante 48 h a 37 °C. Luego se extendieron alícuotas diluidas de cultivos positivos en MM-FOS en placas de sangre ABB-FOS, BHI o TSA y se incubaron durante 48 h a 37 °C. Luego se aislaron clones individuales en placas de sangre ABB-FOS, BHI y TSA y se desafiaron su capacidad de crecimiento en MM suplementado con 0,1% de FOS. Los clones consumidores de FOS se identificaron mediante la secuenciación de los 16 ARNr con los cebadores 27 F y 1492 R. Se agregaron cinco mililitros de ABB-FOS fresco a los cultivos de ABB-FOS restantes y se incubaron durante 24 h a 37 °C. Se incubaron alícuotas de este cultivo en 5 ml de MM-FOS y se aislaron clones adicionales como se describe anteriormente. Se realizaron un total de cinco pasajes.

No se utilizó ningún método estadístico para predeterminar el tamaño de la muestra. No se excluyeron datos de los análisis. Todas las réplicas son réplicas biológicas independientes con un mínimo de n = 3. El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism 9.3.0. La importancia estadística de los experimentos de etiquetado de K. oxytoca y L. acidophilus en comparación con el control (Fig. 1d) se determinó mediante la prueba t no apareada con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni-Dunn. Todos los demás experimentos de etiquetado (Figs. 1, 2, 4 y 5) se determinaron mediante ANOVA unidireccional con la prueba de comparación múltiple de Bonferroni comparando todas las columnas con la muestra etiquetada. El análisis de abundancia diferencial que compara la abundancia de ESV en las heces iniciales versus las muestras de glicano+ en la Fig. 3 se determinó mediante un análisis DESeq2 y se muestra utilizando el valor de P ajustado. Los experimentos no fueron aleatorios ya que las tres muestras de heces se incubaron con los tres glicanos fluorescentes. Todas las pruebas estadísticas realizadas se detallan en los pies de las figuras correspondientes.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación 16S y secuenciación metagenómica generados en este estudio se han depositado en la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) con el código de acceso de Bioproyecto PRJNA925842. Las secuencias de bacterias aisladas informadas en este artículo se han depositado en la base de datos NCBI GenBank con los números de acceso: B. xylanisolvens CLD22001 (OP510057), B. angulatum CLD22003 (OP512543), B. caccae CLD22004 (OP512560), B. uniformis CLD22005 ( OP514970) y E. coli CLD22006 (OP514723). Las secuencias ANCHOR ESV están disponibles como un archivo separado (Datos complementarios 1). Los datos de origen y los detalles estadísticos se proporcionan como un archivo de datos de origen. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Esta investigación fue financiada por una subvención catalizadora (DO-16) de la Red Canadiense de Glycomics (GlycoNet) para BC y CFM y por la subvención PJT-437944 de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR) para BC y CFMBC tiene una Cátedra de Investigación de Canadá de nivel II ( CRC) en Química Terapéutica. CFM tiene un CRC de nivel II en Fisiología microbiana intestinal y es Azrieli Global Scholar en el programa Humanos y Microbioma. JX tiene un CRC de nivel II en Bioinformática y Análisis de Big Data. La secuenciación se realizó en la Universidad McGill y en el Centro de Innovación Genoma de Quebec. La citometría de flujo se realizó en las instalaciones centrales de citometría de flujo del Complejo de Ciencias de la Vida de la Universidad McGill, que cuenta con fondos de la Fundación Canadiense para la Innovación. La adquisición de imágenes de fluorescencia y el experimento de biología molecular (PCR y cuantificación de nanogotas) se realizaron con el equipo de la Plataforma de Biología Molecular y de Imágenes de la Universidad McGill (IMBP).

Departamento de Farmacología y Terapéutica, Universidad McGill, 3655 Prom. Sir-William-Osler, Montreal, Quebec, H3G 1Y6, Canadá

Lharbi Dridi, Fernando Altamura, Olivia Lui, Ryszard Kubinski, Reilly Pidgeon, Adrian Montagut y Bastien Castagner

Centro Canadiense de Genómica Computacional, McGill Genome Center, 740, Dr. Penfield Avenue, Montreal, Quebec, H3A 0G1, Canadá

Emmanuel Gonzalez

Departamento de Genética Humana, Universidad McGill, Universidad 3640, Montreal, Quebec, H3A 0C7, Canadá

Emmanuel Gonzalez

Gerald Bronfman Departamento de Oncología, Universidad McGill, 5100 Boulevard de Maisonneuve West, Montreal, Quebec, H4A 3T2, Canadá

Emmanuel Gonzalez

Instituto de Parasitología, Universidad McGill, 21111 Lakeshore Rd, Ste-Anne-de-Bellevue, Quebec, H9X 3V9, Canadá

Jasmine Chong y Jianguo Xia

Centro McGill para la Investigación del Microbioma, Universidad McGill, Montreal, Quebec, Canadá

Corinne F. Mauricio

Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad McGill, 3773 University Street, Montreal, Quebec, H3A 2B4, Canadá

Corinne F. Mauricio

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LD diseñó y llevó a cabo los experimentos de microbiología. FA, OL, RK, RP y AM realizaron la síntesis y caracterización de las sondas, así como experimentos de absorción preliminares. EG realizó los análisis bioinformáticos. JC y JX realizaron el análisis metagenómico. BC y CFM concibieron y supervisaron el proyecto. BC escribió el manuscrito con CFM, LD, FA, OL y RK. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Corinne F. Maurice o Bastien Castagner.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Dridi, L., Altamura, F., González, E. et al. Identificación de consumidores de glucanos en muestras de microbiota intestinal humana mediante etiquetado metabólico junto con clasificación de células activada por fluorescencia. Nat Comuna 14, 662 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36365-8

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Recibido: 14 de octubre de 2022

Aceptado: 26 de enero de 2023

Publicado: 07 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36365-8

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